北京基因突变荧光定量PCR分析服务 欢迎咨询 上海朝瑞生物科技供应

来源: 网络整理 2020-02-14

在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸:5’端标记一个报告荧光基团,北京基因突变荧光定量PCR分析服务,3’端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时,北京基因突变荧光定量PCR分析服务,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,北京基因突变荧光定量PCR分析服务,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号。

在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号**扩增阶段任意位置上,但一般荧光阈值的设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍。

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荧光定量PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase ChainReaction,FQ-PCR;real-time quantitative PCR, RT-qPCR or qPCR), 是1996 年由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术,它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,标记**PCR产物进行实时监测反应,利用与之相适应的软件对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度 [1]  。

荧光域值(threshold)的设定:PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号标准偏差的10倍

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Ct(阈值循环)是扩增曲线与阈值线的交叉点(图 1B)。它是 PCR 反应中靶标浓度的相对测量。除靶标浓度之外,还有很多因素会影响 Ct 的***值。我们将要讨论最常见的可能影响 Ct 值的非模板依赖性因素,并描述如何评估实时荧光定量 PCR 反应的性能。

显示实时反应扩增图的几个参数。图 1B 中的**期对应于图 1C 中的线性期。阈值必须设在扩增图的线性期中。Ct 值随模板量减少而增加。然而,反应混合物或仪器中的任何干扰,只要能影响与 Ct 计算相关的荧光测定,都会使 Ct 值产生非模板依赖性的变化。因此,在不同条件下或用不同试剂进行的 PCR 反应产生的 Ct 值不可以直接进行比较。

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